Post-mortem bewaren van genetica bij merries of hengsten
Het zal je maar overkomen: je meest waardevolle merrie of hengst komt ongelukkig neer na een hindernis en breekt een been. De dierenarts komt ter plaatse, maar de breuk is desastreus waardoor het paard ingeslapen moet worden. Naast het grote verlies bedenk je dat je geen enkele nakomeling hebt van dit paard. Hier houdt het dan op… of toch niet?
Gelukkig bestaan er mogelijkheden om de genetica post-mortem te bewaren, zowel bij de merrie als bij de hengst.
Mogelijkheden bij de merrie
Er is nog een allerlaatste kans om toch een nakomeling, of in het allerbeste geval meerdere nakomelingen, te verkrijgen van een merrie bij sterfte. Op de eierstokken van de merrie zijn er namelijk follikels aanwezig, waarin de eicellen of dus de vrouwelijke geslachtscellen, opgeslagen zitten. Het spreekt dan ook voor zich dat hoe meer follikels er aanwezig zijn op het moment van sterfte, hoe groter de kans is op het bekomen van een nakomeling. Naast het aantal follikels spelen er nog verschillende andere factoren een rol, waaronder de leeftijd van de merrie, de aandoening waaraan ze lijdt... Wat zeker niet onderschat mag worden, is dat de correcte behandeling van de eicellen eveneens cruciaal is om de kans op succes te verhogen.
Tijd dringt De factor ‘tijd’ is een heel belangrijk gegeven in het hele proces. Zodra de merrie sterft, moet er zo snel mogelijk ingegrepen worden. Om de eierstokken te verwijderen, moet er een incisie gemaakt worden achter de laatste rib tot in de buikholte. Eens de buikholte geopend is, wordt op zoek gegaan naar de eierstokken en worden deze voorzichtig weggesneden. Dit kan door de dierenarts ter plaatse uitgevoerd worden. In het geval van euthanasie wordt het paard eerst verdoofd, zoals bijvoorbeeld bij een liggende castratie wordt gedaan. Indien het paard voldoende onder invloed is van deze verdoving, wordt de incisie gemaakt en worden de eierstokken zo snel mogelijk gecollecteerd. Meteen daarna wordt het product voor de eigenlijke euthanasie toegediend. Het is belangrijk om deze volgorde te respecteren, aangezien de medicatie voor de euthanasie via de bloedbaan wordt verspreid en zo een schadelijk effect kan hebben op de eicellen.
De collectie van de eicellen uit de eierstokken, evenals de incubatie en bevruchting van deze eicellen dient in een gespecialiseerde instelling te gebeuren. Een belangrijke tijdslimiet die hierbij gerespecteerd moet worden is dat de eierstokken binnen de 6 uur na sterfte in het labo aanwezig moeten zijn. Het blijft echter steeds gelden: hoe vroeger, hoe beter en hoe meer kans op succes. Indien de eierstokken binnen de 2 uur na sterfte verwerkt kunnen worden, moeten deze getransporteerd worden op lichaamstemperatuur. Zal het hele proces langer duren, dan mogen ze afkoelen tot kamertemperatuur, maar niet lager, vermits eicellen gevoelig zijn aan koude.
In het labo Eens aangekomen in het laboratorium worden de eierstokken nog eens gereinigd, waarna het verzamelen van de eicellen kan beginnen. De eierstokken worden hiervoor grondig bekeken en elke follikel – die follikelvocht en een eicel bevat – wordt geopend. De wanden worden geschraapt en herhaaldelijk gespoeld (zie foto). Op deze manier wordt elke follikel aangesneden en probeert men om zoveel mogelijk eicellen terug te vinden.
De verkregen eicellen zijn meestal nog in het onrijpe stadium. Deze moeten dus nog op cultuurplaatjes verder rijpen in het labo. Niet alle verkregen eicellen zullen in staat zijn om te rijpen. Enkele diegenen die binnen een bepaalde tijdspanne effectief gerijpt zijn, zullen bevrucht kunnen worden.
Bevruchting en dracht Deze bevruchting gebeurt met behulp van de ondertussen alom bekende techniek: ICSI. Dit staat voor intra-cytoplasmatische sperma-injectie. Bij het paard treedt geen bevruchting op indien een spermacel en een eicel onder laboratoriumomstandigheden samen worden gebracht, dit in tegenstelling tot bijvoorbeeld het rund of de mens. Bij het paard dient de spermacel geïnjecteerd te worden in (het cytoplasma van) de eicel, vandaar de benaming. Er moet dus ook al vrij snel een keuze gemaakt worden met betrekking tot de hengst die gebruikt zal mogen worden.
Na de sperma-injectie van alle rijpe eicellen treedt er opnieuw een selectie op, vermits niet alle eicellen bevrucht zullen zijn. Indien er bevruchting is opgetreden, zal er celdeling waargenomen kunnen worden. In het beste geval zet deze celdeling zich mooi verder, zodat er, gemiddeld 7-10 dagen na de ICSI, een transplanteerbaar stadium van een embryo verkregen wordt. Dit embryo kan ingevroren worden of meteen in een mogelijke draagmerrie worden overgezet.
Indien er een embryo verkregen wordt, dan staat dit natuurlijk niet gelijk aan een veulen. Dit embryo moet nog geaccepteerd worden door de receptormerrie. In het geval dat er een dracht verkregen wordt, dan is het gevaar nog niet geweken. In vitro verkregen embryo’s, dit wil zeggen embryo’s die in het labo worden verwekt, hebben een grotere kans op vroeg embryonale sterfte.
Het invriezen van de eicellen vóór de bevruchting zou eveneens een goede optie zijn, maar de wetenschap staat nog niet ver genoeg om dit commercieel aan te kunnen bieden zonder dat de eicellen te veel aan kwaliteit moeten inboeten.
Mogelijkheden bij de hengst
De geslachtscellen bij de hengst (de zaadcellen) worden geproduceerd in de testikels en opgeslagen in de bijballen (epididymes). Net zoals bij de merrie, blijven deze na de dood van de hengst nog even bewaard.
De factor ‘tijd’ is opnieuw belangrijk: hoe sneller de zaadcellen na sterfte gerecupereerd kunnen worden, hoe beter. Dit geldt trouwens niet alleen bij sterfte, maar ook bij bijvoorbeeld castratie. Indien de testikels op een correcte wijze verwijderd worden en indien deze goed getransporteerd worden naar een daarvoor ingericht labo, dan kunnen hieruit zaadcellen verkregen worden. Net zoals bij de merrie zijn er verschillende factoren die dit proces beïnvloeden, denk maar aan de leeftijd van de hengst, de reden van sterfte…
Invriezen Het voordeel bij de hengst is dat het proces van invriezen van zaadcellen al veel langer bekend is en al verschillende jaren met succes wordt uitgevoerd. Er moet hier wel een kanttekening bijgemaakt worden: de zaadcellen die opgeslagen zitten in de bijbal bevinden zich in de laatste fase van de rijping. Deze hebben dus niet dezelfde bevruchtingskracht als de zaadcellen van een normaal ejaculaat. Het gebruik van een hogere inseminatiedosis is aan te raden. Desondanks zal het drachtpercentage lager liggen ten opzichte van een inseminatie met diepvriessperma dat via de routineprocedure werd afgenomen en ingevroren.
Zoals reeds vermeld, is de bijbal hier het meest belangrijk en nog meer specifiek, het laatste stuk van de bijbal, de cauda epididymis genaamd. Vanuit deze cauda worden de zaadcellen via de zaadleider getransporteerd (zie foto). Deze zaadleider, ductus deferens genaamd, is dus ook belangrijk in het proces. Bij het verwijderen van een testikel wordt de zaadleider idealiter zo hoog mogelijk weggesneden en afgebonden zodat er geen lekkage is van spermacellen. Een belangrijk verschil met de eicellen is dat de zaadcellen beter bewaren als ze afgekoeld worden. Bij opwarming zullen ze meer beweeglijk zijn en kostbare energie verbruiken, waardoor de leefbaarheid en de bevruchtingskracht van de zaadcellen zal verminderen. Dit is de reden waarom testikels bij koelkasttemperatuur (5 °C) getransporteerd moeten worden.
Collectie van zaadcellen De eigenlijke collectie van de zaadcellen kan op 2 manieren gebeuren.
Een eerste methode maakt gebruikt van flotatie. Dit is een eenvoudige techniek waarbij enkele incisies worden gemaakt in de cauda epididymis en in de zaadleider. Deze worden vervolgens in een schaaltje gelegd waarin zich spermaverdunner bevindt. Gedurende 10 minuten krijgen de spermacellen de kans om vanuit hun stockageplaats in het medium te zwemmen. Vervolgens wordt het medium met daarin de spermacellen verder verwerkt.
Een tweede methode is de retrograde flushing. Deze geniet de voorkeur, vermits er een hogere opbrengst wordt verkregen en er minder kans is op contaminatie met bijvoorbeeld bloed of andere onreinheden. Bij deze techniek wordt er een soort katheter in de zaadleider geplaatst waaraan een spuit wordt gekoppeld. Deze spuit is gevuld met spermaverdunner. Op de overgang van de ‘staart’ van de bijbal naar het ‘lichaam’ van de bijbal (corpus epididymis) wordt een incisie gemaakt. Op deze manier worden de spermacellen in de tegenovergestelde richting van een normale zaadlozing uitgespoeld, vandaar de benaming ‘retrograde flushing’ (foto). De uitgespoelde spermaverdunner waarin normaliter miljoenen tot miljarden spermacellen aanwezig zullen zijn, wordt opgevangen in een recipiënt en kan zo verder verwerkt worden.
Dit sperma wordt vervolgens ingevroren, zodat het gebruikt kan worden voor kunstmatige inseminatie of voor de hierboven besproken ICSI.
Het kan, maar er is geen garantie
De evoluties in de reproductieve paardengeneeskunde maken zeer veel mogelijk. Zo is het verkrijgen van een veulen van een overleden merrie wonderbaarlijk. Weet echter dat de kosten van deze recente technieken samen met de huur van een draagmerrie etc. hoog kunnen oplopen. Bovendien kan niemand enige garantie op succes waarborgen.
Bij de hengst zullen de kosten minder hoog oplopen en afhankelijk van de gerecupereerde concentratie en de kwaliteit van het sperma, is er een reële kans om van een recent gestorven of gecastreerde volwassen hengst toch nog nakomelingen te verkrijgen.
